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志贺氏菌属LAMP检测试剂盒图片
产品货号:
BTN16-40000
中文名称:
志贺氏菌属LAMP检测试剂盒
英文名称:
Shigella spp. LAMP Kit
产品规格:
50次
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价
本产品是基于环介导等温扩增(LAMP)开发,专门用于检测志贺氏菌属的试剂盒。


志贺氏菌属(Shigella Castellani)是一类革兰阴性短小杆菌,是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌,主要流行于发展中国家,通称痢疾杆菌,耐寒,能在普通琼脂培养基上经过24小时生长,形成直径达2mm大小、半透明的光滑型菌落。在肠道杆菌选择性培养基上形成无色菌落。大小为0.5~0.7×2~3μm,无芽胞,无荚膜,无鞭毛,多数有菌毛。革兰氏阴性杆菌,是人和灵长类动物的肠道致病菌,引起细菌性痢疾。因此快速灵敏检测志贺氏菌具有重要意义。


  1. 对20μL的反应体系,最大样品加样量达到14μL。
  2. 含可见光和荧光染料,既可以用金属浴和水浴扩增用可见光肉眼判断结果,也可用荧光PCR仪进行实时荧光检测。
  3. 内含的dUTP-UNG可防交叉污染。
  4. 特异性比PCR高,因为LAMP扩增使用4~6条引物而不是两条。
  5. 假阴性率低。
  6. 提供无传染性的阳性对照,便于分析实验结果。
  7. 本产品足够50次20μL体系的LAMP扩增和检测反应。
  8. 只可用于科研,只可进行定性检测,不能用于定量检测。



组分规格
5×荧光及可视化LAMP MagicMix200μL
Bst DNA聚合酶2.0(8U/μL)50μL
20×志贺氏菌属通用LAMP引物混合液50μL
志贺氏菌属通用LAMP阳性对照(1×103拷贝/μL)150μL
超纯水1mL

保存:-20℃,有效期一年。


准备工作:
如果使用水浴锅或金属浴,需要在实验启动前打开并调到65℃。如果用金属浴,还必须在孔中加水以填充金属孔和反应管间的空隙。金属浴和水浴温控远远不如PCR仪器,所以使用前需要用阳性对照和阴性对照(水)做预实验确认可用。

一、样品DNA的制备
  1. 用自选方法纯化样品的DNA,本试剂盒跟市场上大多数DNA提取试剂盒兼容。
  2. 如果有N个样品,则至少需要做N+2个样品制备,包括一个制备阳性对照(制备时加入自备的跟要检测的靶分子相同的阳性对照模板,一起经历提取过程)和一个制备阴性对照(用水替代样品)。最后N+2个样品一起进行DNA提取操作,得到N+2个DNA样品。


二、荧光及可视化LAMP扩增及检测(20μL体系)
  1. 第一次使用本试剂盒时,一次性地将50μL的Bst DNA聚合酶2.0全部加入到200μL的5×荧光及可视化RT-LAMP MagicMix中,轻柔颠倒混匀,然后每个20μL反应用5μL
  2. 反应设置:如果有N+2个DNA纯化样品,则最好设置N+4个LAMP扩增,增加LAMP阴性对照和LAMP阳性对照各1个。在N+4个0.2mL PCR管中加入下列成分:
    成分N+2个样品管LAMP阴性对照LAMP阳性对照
    5×荧光及可视化LAMP MagicMix各4μL4μL4μL
    20×志贺氏菌属通用LAMP引物混合液各1μL1μL1μL
    N+2个样品DNA各14μL--
    超纯水-14μL-
    试剂盒提供的阳性对照(1×103拷贝/μL)--14μL
    Bst DNA聚合酶2.0(8U/uL)各1μL1μL1μL

  3. 混匀后进行扩增。由于本产品含双染料,可以根据实验室条件选择下列三种方式进行扩增和检测。
  4. 如果使用PCR仪、金属浴或水浴进行扩增,肉眼检测,则必须先在每个反应管中加30μL自备的石蜡油,否则保温期间反应体系的水分会蒸发,影响反应效率(如果使用PCR仪器并开启热盖,则可以不加石蜡油)。61℃保温90分钟,肉眼观察管内液体颜色。
  5. 如果使用荧光定量PCR仪:设为61℃保温1分钟/循环,90个循环,每分钟在FAM通道采集一次荧光信号。
  6. 如果使用PCR仪、金属浴或水浴进行扩增,再使用qPCR仪进行终点法荧光读数:则在扩增前和扩增后,分别在qPCR仪器上测荧光读数(温度设为61℃,1次循环,每次循环1分钟,在FAM通道采集一次荧光信号。
    注意:测荧光读数必须在61℃进行)。扩增反应按65℃ 90分钟进行。


三、结果分析及解读
  1. 如果是用普通PCR仪器、水浴或金属浴进行的扩增,反应结束后只能肉眼判断结果。将反应管放置在白色背景(如白纸)前观察。扩增阳性对照管内反应液将呈现蓝色,无模板和无引物的阴性对照将呈浅蓝色。如果扩增阳性对照管内反应液不呈现蓝色,或无模板和无引物的阴性对照任何一个呈现蓝色,则说明试剂有问题,实验无效。请跟厂家联系。
  2. 如果实验有效,则分析N+2个样品管的结果。如果样品管反应液的颜色接近扩增阳性对照管则说明有扩增,如果接近无模板和无引物的阴性对照,则说明无扩增。反应结果示例见左图(9为阴性,10为阳性)。
  3. 如果是用荧光PCR仪进行扩增,则可分析扩增曲线和Ct。试剂盒提供的阳性对照的Ct将小于60,如果大于60,说明试剂可能失效,需跟厂家联系。无模板阴性对照和无引物阴性对照的Ct将大于90。如果任何小于90,则说明试剂或环境被污染,需重复实验或跟厂家联系。如果阳性对照和阴性对照Ct都在正常范围,则分析样品的Ct。Ct小于60的判断为阳性,大于90判为阴性,在60~90之间则需要重复检测。
  4. 如果使用PCR仪、金属浴或水浴进行扩增,肉眼检测,再使用荧光定量PCR仪进行终点法荧光读数来判断阴阳性,则先比较阳性对照和阴性对照。阳性对照样品扩增后信号增幅应该超过100%,阴性对照扩增后信号增幅应该低于50%,否则实验无效,请与厂家联系。如果两个对照均有效,则比较样品扩增前后荧光读数的差值。如果扩增后荧光信号增幅低于50%,则判断为阴性。如果荧光信号增幅高于100%,则判断为阳性。荧光信号增幅在50~100%之间的,则需要重测。
  5. 当实时荧光检测和可视化检测同时用于判读结果时,如果彼此不一致,以实时荧光LAMP的数据为准。一般可视化结果滞后实时荧光检测结果
    20~30分钟,也就是说,在qPCR仪上第30分钟时呈现阳性的样品,其反应液的颜色变化一般在第50~60分钟时才能观察到。




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